對於（yú）檢測實驗（yàn）室的工作人員（yuán）來說，檢驗方法的驗證和步驟的確認是必須了解的知（zhī）識。現（xiàn）對（duì）檢（jiǎn）驗方法的驗（yàn）證和確（què）認步驟及詳細計算方法進行（háng）整（zhěng）理，供各位學習參考。
一、檢驗方法驗證的基本內容
檢驗方法驗證的基本（běn）內容包括方案的起草及審批，檢測儀器的確認。
適用性（xìng）驗證（zhèng）（包括準確度試驗、精密度測定、線性範圍（wéi）試驗、專屬性試驗等）和結果評價及批準四個的方麵。
二、檢驗方法驗證的基本步驟（zhòu）
首先是製定驗證方案，然（rán）後對大型精密儀器進行確認，最關鍵的一步是檢驗方法的適用性試驗，最後（hòu）是檢驗方法評價及批準。
1、驗證方案的製定
檢驗方法（fǎ）的驗證方案通常由質量驗證小組提（tí）出。根據產品的（de）工藝條件（jiàn）、原輔料化學結構、中間體、分解產物查閱有關（guān）資料，提出規格標準，確定檢查項目，規定雜質限度，即為質量標準草案。
根據質量標準草案確定檢查和試驗（yàn）範圍，對檢驗方法擬定具（jù）體操作步驟，最後經有關人員審批方（fāng）可實施。
2、大型精密（mì）儀器的確認（rèn）
分析（xī）測（cè）試中所用的檢測儀器一般可分為三類：
A、普通儀器（qì）：崩解儀，折光儀（yí）、分析天平、酸度（dù）計、溶點測定儀、電導（dǎo）儀等：
B、較精密（mì）儀器：旋光儀、永停滴定儀、費休氏水分測定儀、 自動滴定儀、藥物溶出度（dù）儀、可見分光光度計、電泳儀等；
C、大（dà）型精密儀器：紫（zǐ）外分光光度計、紅外分光光度計、氣相（xiàng）色譜儀、高效液相色譜儀、薄層掃描儀（yí）等（děng）。
為了保證分析測試數據準確（què）可靠，每台檢測（cè）儀器在投入正式使（shǐ）用之（zhī）前都應進行確認。
檢測（cè）儀器的確認是檢驗方法驗證的基礎，應（yīng）在其（qí）它驗證試驗開始之前首（shǒu）先完成。
檢測儀器（qì）確認工（gōng）作內（nèi）容應根據（jù）儀器類型。技術性能而定，通常包括：安裝（zhuāng）確認、校正、適用性預（yù）試驗和再（zài）確認。
3、校正
校正是儀器確認及檢驗方法驗證中的一個重要環節，應當在驗（yàn）證試（shì）驗（yàn）以前進行校正。紫外（wài）分光光度計校正包括波長校正、吸（xī）收度測試、準確度測試、雜散光檢查。
氣相色譜（pǔ）儀與高效液相色譜儀均要求做係統適（shì）用性試驗。在規（guī）定的（de）色譜條件下測定色譜柱的最小理（lǐ）論塔板數。分離度和拖尾因子（zǐ），並規定變異係（xì）數應不大於2％。
對於化學檢驗中使用的計量儀器（qì）包括（kuò）容（róng）量瓶、移液管、滴定管、分析天（tiān）平（píng）亦均應校正。
4、適用性預試（shì）驗
儀器的安裝確認完（wán）成以後，在其功能試驗符合要（yào）求的情況下，應用標準品或對照品對（duì）其進行適用性檢查，以確認儀器是否符合使用要求。
例如對熔點測定儀的適用性預試驗是采（cǎi）用已知溶點的甲硝唑做試驗，測（cè）試結（jié）果與已知熔點比較。
紫外分光光度計可（kě）用（yòng）已知含量的某標準（zhǔn）品試驗，測得結果與已知數值對比，確定儀器是否符（fú）合（hé）使用要求。
在完成上述各項試驗（yàn）工作的同時，應做好相應的文件記錄等資料歸檔工作，每一台儀器均（jun1）應有一套完整（zhěng）的檔案資料。
5、再確認
為了確（què）保儀器處於良好（hǎo）的使用狀態，對（duì）於一台新購買的儀器在（zài）確認工作結束以後，應根（gēn）據（jù）儀器的類別。確認的經驗製定再確認的計劃。
再確認（rèn）的時間間隔和內（nèi）容要根據儀器類（lèi）別和使用情況決定，一般是3個（gè）月、6個月或1年。
儀器再確認（rèn）的內容通常包括線路連接、附件備品消耗檢（jiǎn）查、清潔工作、功能試驗、工作日記（jì）等，其中重點安裝確（què）認中的功能試驗。
三、檢驗方法的適用性驗證
藥品質量標準分析方法驗證的目的是證（zhèng）明采用的方法適合於相應的檢（jiǎn）測要求。
在起草藥品（pǐn）質（zhì）量標準時，分析方法需經驗證：在藥物生產方法（fǎ）變更、製劑的組（zǔ）分變更、原分析（xī）方法進（jìn）行（háng）修訂時（shí），則質量標準分析（xī）方法也（yě）需進行驗證（zhèng）。
方法驗證過程和結果均（jun1）應記載在藥品標準起草（cǎo）或修訂說明中。
根據《中國藥典》 (2010版)附錄（lù）XIXA的原則要求，檢驗方法的驗證可分（fèn）為三種（zhǒng）情況處理；
1、無需驗證的（de）方法（fǎ）。如藥典（diǎn）(包括USP、EP、CP、JP等各國藥典)的方（fāng）法，一般（bān）隻做係統適（shì）用性試驗，以確認係統是（shì）否（fǒu）符合（hé）要求(主要指儀（yí）器穩定性及柱的分離度是否達標)。
2、對比（bǐ）法。已在參比（bǐ）實驗室驗證過的分析方法，可用對比試驗的（de）方法來確認方法的可靠性（xìng），即將本實驗室與參比實驗室用同（tóng）一方法對同批樣品所測數據進行比較(如至少取五個批（pī）號，每批重（chóng）複測定五次)，判斷方法在本實驗室的可行性。
如有差異需查明原因或設計方案，對方法進行（háng）再驗（yàn）證。
3、需（xū）進行係統驗證的方法。
四、檢驗方法的評（píng）價及批準
安（ān）裝確認及適用性（xìng）試驗結束後，應將試驗數據資料進（jìn）行匯總分析。對檢驗方法作出正確的評價，驗證報告的說明及結論（lùn）部分應簡明扼要。
試驗中的主要偏差應有適當解釋。然後，報（bào）主管領導審批。檢驗方法驗證的最終（zhōng）產物是一個經過驗（yàn）證的方法—根據驗證的結果製（zhì）訂的由有關領導批準的（de）檢驗方法。
五、如何詳（xiáng）細計算檢（jiǎn）出限？
在如何正確或準確地估算檢出限（xiàn）的問題上,國際分析界一直存有（yǒu）爭議（yì）。檢出限的特殊意（yì）義在（zài）於可以對（duì）一個給定的（de）分析方（fāng）法在低濃度水（shuǐ）平的檢測能力（lì）進行準確地評估，而考察一個分析方法（fǎ）在低濃度範圍的檢測性（xìng）能，可以基（jī）於不同的角（jiǎo）度或不同的側重點,如可以從最小信（xìn）號值與儀器噪音之比來考察（chá），從方法測定空白的平均波動性來統計估算,也可以根據分析方法（fǎ）校準曲線的偏（piān）差特性來（lái）定量估（gū）算等等。
檢出限（xiàn）是評價一個分析方法及（jí）測試儀（yí）器性能的重要指標,所謂“檢出”是指定性檢出，即判定樣品中存在有濃度高於空白的待測物質。
ACS(美國化學學會)對這一定義作了（le）更簡明的概括:檢出限是一個分析方法能夠可靠（kào）地檢測出被分析物（wù）的最低濃度。
1、檢（jiǎn）測限（limit of detection, LOD）定義:
在樣品中能檢出的被測組分的最低濃度（量）稱為檢測限，即產生信號（峰高）為基線噪音標準差k倍時的（de）樣品（pǐn）濃度，一般為信噪比（S/N）2:1或3:1時的濃度，對其測（cè）定（dìng）的準確度和精密度沒有確定的要求。目前，一般將檢測（cè）限定義為信噪比（S/N）3:1時的濃度。
2、計算公式為（wéi）：
D=3N/S （1）
式中：N——噪音（yīn）; S——檢測（cè）器靈敏度；D——檢測限
而靈敏度的計算（suàn）公（gōng）式為：
S=I/Q （2）
式中：S——靈敏度；I——信號響（xiǎng）應值；Q——進（jìn）樣量
將式（1）和式（2）合並，得到下式：
D=3N×Q/I (3)
式中：Q——進樣量；N——噪（zào）音；I——信號響應值。I/N即（jí）為該進（jìn）樣（yàng）量下的信噪比（S/N），該信噪比可通過（guò）工作站對圖譜進行自動分析獲得，一般的（de）色譜或質譜（pǔ）工作（zuò）站都可進行信噪比分析計算。這樣（yàng）檢測限（xiàn）的計算方法就（jiù）變得非（fēi）常（cháng）方便了。
3、計算（suàn）方法：
實際計算時，檢出限有2種表示方法：一種是進樣（yàng）瓶中樣（yàng）品檢測限，一種是針對原始樣品的方法檢出限。
A、對第一種檢測限，隻（zhī）要知道進樣量（liàng）和信噪比即可計算。如進樣瓶中樣品濃度為1 mg/L,在此濃度下的信噪（zào）比為300(由工作站分析獲得)，則其檢測限為：D =（3×1 mg L-1）/300 = 0.01 mg/L。也可用絕對進（jìn）樣量表示，若進樣體積為10 ul，則其檢測限為（wéi）：D = 3×（1 mgL-1×10 ul）/300 = 0.1 ng。
B、對第二種表示方法，需同時考慮原始樣品的取樣量和提取樣品的定容體積。仍按前述樣品（pǐn）計算，若取樣量為5克，最後定容體積為5 mL，則（zé）方法檢測限為：D = 0.01 mgL-1×5 mL/5 g = 0.01 mg/kg。
即當原始樣品中待檢物質的濃度為0.01mg/kg時，若取樣量（liàng）為5g,樣品經前處理後定容體積為5mL時,進樣瓶（píng）中（zhōng）樣品的濃度可達0.01mg/L（假定回收率為100%）,此時，在其它給定的分析條件下，能產生3倍噪聲強度的信號（hào）。在實際檢測工作中，第二種表示方法更為常見。
4、注意事項
由式（3）可見，信（xìn）噪比的大小直接關係到（dào）檢（jiǎn）測限的大小。信噪比計算方法（fǎ）的不同，其比（bǐ）值大小有很大不同，這與計算信噪比時基線噪聲峰值的定義方式有關，一般有（yǒu）三種不同（tóng）的定義：
A、峰/峰（fēng）（peak to peak）信噪比，用某一段基線（xiàn）噪聲的平均高度；
B、峰/半峰（half peak to peak）信噪比, 用某一段基線噪聲平均高度的1/2；
C、均方根（RMS）信噪比，用某（mǒu）一段基線噪聲的均方根值計算。
除此之外（wài），信噪比的計算結果還和所取噪聲的位置有很大關（guān）係（xì），取信號哪一側基線的噪聲，取多長一段（duàn）基線上（shàng）的噪聲，計算結果都很不完（wán）全相同，有時相差甚遠。一般多取樣品峰兩側（cè）的噪聲（shēng）峰值計算。
5、檢出限的確（què）定
A、《全球環境監測係統水（shuǐ）監測操作指南》中規定：給定置信水平為95%時，樣品測定值與零濃度（dù）樣品的測定值有顯著性差異即為（wéi）檢出限：
L = 4.6Sb
式中：L——方法的最低檢出濃度（dù）。
Sb ——測定次數為n次（cì）的空（kōng）白平行（háng）測定（批內（nèi））標準差（重複測定20次以上）。
B、國際純粹（cuì）和應用化學聯合會（IUPAC）規定對各種光（guāng）學分析方法，可用下式計算：
L = KSb/S
L——方法的最（zuì）低檢出濃（nóng）度
Sb——空白多次測量的標（biāo）準偏差（吸（xī）光度）；
S ——方（fāng）法的靈敏（mǐn）度（即校準曲線的斜（xié）率）
為了評（píng）估 ，空白測定次數必須足夠多，最好能測20次。國際（jì）純粹和應用化學聯合會極力提倡取k值為3，一般來說，取 相應的置信水（shuǐ）平大約為90%。
若 =0，並（bìng）不意味著 ，或檢出限無限小。這時需配製一個濃（nóng）度略大於（yú）零濃度的（de）試樣係列（能產生一個可測信號值）代替全程序空白試驗，求出其（qí）標準偏差，用來代替（tì） 。
此外，有時為（wéi）了工作（zuò）方便和便於比較，也規定一（yī）個（gè）大家能接受的（de）信號值作為檢出（chū）限，如分光（guāng）光（guāng）度法中，規定吸光（guāng）度為0.010所（suǒ）對（duì）應的濃度即為檢出限L。
C、 美國EPA SW—846規定方法中的檢出限為：
L=3.143Sb
D、某些分光光度法是以吸光（guāng）度（扣（kòu）除（chú）空白）為0.010相對應的濃度值或絕對量為檢出限，這是一種實驗（yàn）室間的協（xié）定方（fāng）案（àn）。
E、氣相色（sè）譜法：檢測器恰能產生（shēng）與噪音相區別的響（xiǎng）應信號（hào）時所需進入色譜的物質最小（xiǎo）量為檢出限，一般（bān）為噪音的二倍。
F、離子選擇電極（jí）法：當（dāng）校（xiào）準曲（qǔ）線（xiàn）的直線部（bù）分外延的延長線與通過空白電位且平行於濃度軸的直線相交時，其交點（diǎn）所對應的濃度值即（jí）為該離子色譜所對電極法的檢出限。
由測得的空白值計算出（chū）的L值不應大於分析方法（fǎ）規定的（de）最低檢出濃度值，如大於（yú）方法規定值時，必須（xū）尋找原因降低空白值，重新測定計算至合格。
6、校（xiào）正曲線繪製：
A、按分析方法步驟，通過實測濃度和儀器（qì）信號值的（de）直線關（guān）係（xì），確定實驗室條件下的測定上限。當測定上限低於方法的檢測上（shàng）限時，隻（zhī）能用實測的直（zhí）線（xiàn）範圍。
B、繪製（zhì）校正曲線的分析步（bù）驟應與樣品分析相同，並且不少於5個濃度值。
C、校（xiào）正曲線繪製與（yǔ）每批測（cè）定樣品同時進行，對某些分（fèn）析方法的校正曲線的斜率穩定，批間誤差較（jiào）小，使用原製校正曲線時，應與樣品同（tóng）時測定2份中等濃度標樣和2份空白的平行樣（yàng）。
測得標準的濃度（減去空白）值與原（yuán）校正（zhèng）曲線相對應的濃度值的相對偏差，分光光度應小於5%；原子吸收法應小於10%，否則重新製作校正曲線。
六、小結
在最後還要特（tè）別強調，檢出限和測定下限是兩個不同的概（gài）念，它們是評價一個分析方法及測（cè）試儀器性能的重要指標，檢出限是一個定性概念，而測定下限（xiàn）是一個定量概念，搞清楚兩者概念和相（xiàng）互關係，可提高色譜分析中檢測（cè）結（jié）果的準確性和可（kě）靠性，特別在痕量分析中，檢（jiǎn）出限和測定下限的確定對於分析方法的選擇具有重要意義，同樣的（de），對（duì）於（yú）實驗室質量控製也具有很重要的意義。
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