正確評價藥（yào）品檢驗中的不確定度是藥物分析中的一個難點，有人對HPLC測定咖啡因的不確定度進行了研究，但尚未（wèi）見關於抗生（shēng）素微生物檢定法測定中含量不確定度的（de）報道。本文以（yǐ）阿奇黴素標準品的含量標定為例，對抗生素微生物檢定法中的不確定度計算進行探討（tǎo）研究，以提高數據分析（xī）和測定結果的準確性和可信度。    

　　一（yī）、實驗部分

　　1.儀器與試劑（jì）
　　ZY-300IV多功能微生物自動測量分析儀(北京先驅威鋒技術開發公司)；BP-211D分析天平(瑞士Sartorius公司（sī）)；電熱（rè）隔水式恒溫（wēn）培養箱(上（shàng）海（hǎi）躍進醫療（liáo）器械廠（chǎng）)；阿奇黴素標準（zhǔn）品(中國藥品生物製品檢定所（suǒ），效價（jià）測定用，946μ/mg，批（pī）號:130352-200304)與阿奇黴素供試品(中國藥品生物製品檢定所)；Ⅰ號7.8～8.0培養基(批號—040212，北京三藥科技開發公司生（shēng）產、中（zhōng）國藥品生物製品檢定所監製)；短小芽孢杆菌〔CMCC(B)63 202〕(中（zhōng）國藥品生物製（zhì）品檢定所（suǒ）)；磷酸二氫鉀與磷酸氫二鉀等試劑均為分析純；水為去離子純化水。

　　2.標準品溶液與供試（shì）品溶液的製備
　　(1)標準（zhǔn）品溶液的製備:精密稱取阿奇黴素標準品（pǐn）0.05285g，加乙（yǐ）醇28mL使之溶解，再加滅菌水定量稀釋至50mL，搖勻，得溶液為1000μ/mL。精密吸取該溶液(1000μ/mL)5.0mL，用磷酸鹽緩衝液(pH7.8)稀釋至50mL，搖勻，得溶液為100μ/mL；再分別精密吸取溶液(100μ/mL)5.0mL，分別用磷酸（suān）鹽緩衝液(pH7.8)稀釋至50mL與100mL，搖勻，得溶液分別（bié）為10μ/mL與5μ/mL，作為標準品溶液的高、低劑量。

　　(2)供試品溶液的製備:精密稱取阿奇黴素供試品0.05260g(估計效價950.6μ/mg)，溶解與稀釋同標準品溶液的製備，得溶液分別（bié）為10μ/mL與5μ/mL，作為供試（shì）品溶液的高、低（dī）劑量。

　　3.雙碟的製備與培養
　　取平底雙碟約10套(n)，分別加入加熱融化的（de）培養基20mL，放置水平台上使凝固，作為底（dǐ）層。另取加熱（rè）融化後的培養基適（shì）量，放冷至50℃，加入短小芽（yá）孢（bāo）杆菌的菌懸液適量，搖勻，在每一雙碟中分別加入5mL，攤布（bù）均勻，作為菌層。冷（lěng）卻後，在每（měi）一雙碟中以等距離安（ān）置不鏽鋼小管4(k)個，待用。將上（shàng）述（shù）稀釋好的標準品溶液與供試（shì）品溶液（yè）分別滴加（jiā）於不鏽鋼小管（guǎn）內，在(35～37)℃恒溫培養箱中（zhōng）培養(16～18)小時。

　　4.抑菌圈直徑的測（cè）定與效價計算
　　取出培養好的雙碟，用抑菌圈測量儀測量各個抑菌圈的直徑，照生物檢定（dìng）統計法(中國藥典2005年版二部附（fù）錄XI V中的2.2法)進行可靠性檢（jiǎn）驗與效價計算。當可靠（kào）性檢驗結果為回歸非常顯著(P<0.01)與偏離（lí）平行不顯（xiǎn）著(P>0.05)時，實驗結果才成立。    

　　二、結果與討論

　　1.數學模（mó）型
　　被測量（liàng）是（shì）供（gòng）試品的效價，它取決於標準品（pǐn）的質量、純度與供試品的質量、標準品溶液產（chǎn）生的直徑、供試品溶液（yè）產生的直徑。抑菌（jun1）圈直徑測定時，分別對10個（gè）雙碟進行掃描測定，測定結果見表1。
    

表1  抑菌圈測量（liàng）的直徑值(d)

　　效價由下式給出:
    

　　式中（zhōng），ms與</i></HTML>mt</i></HTML>分別為標準品與供試品的質量，5mL為移（yí）液管的體積，50mL與（yǔ）100mL均（jun1）為容量瓶的體積。常數0.3010，由濃度間的比（bǐ）率（lǜ）決定，與所用（yòng）雙碟數（shù）無（wú）關，因此，劑距為（wéi）2∶1不變時，增加雙碟數，常數0.3010仍不變。S₂為n個雙碟高濃度（dù）標準品溶液所製的抑菌圈直徑值的總和，S₁為n個雙碟低濃度標準（zhǔn）品溶液（yè）所製的抑（yì）菌圈直徑值的總（zǒng）和；T₂為n個雙碟高濃度供試品溶液（yè）所製的抑菌圈直徑值的總和，T₁為n個雙碟低濃（nóng）度供試品溶液（yè）所製的（de）抑菌圈直徑值的總和。

　　除抑菌（jun1）圈直徑值引起的（de）輸入量的標準不（bú）確定度（dù）外，不確定度還包括標準品和（hé）供試（shì）品的稱重、標準品純度、容量瓶體積、移液管體積、抑菌圈測量儀等。這個合成的不確定度即為（wéi）效價測（cè）定的不確定度。

　　2.各分量的標準不確定度
　　(1)抑菌圈（quān）直徑值的不確定度分量u(x₁)
　　對抑菌圈直徑的數（shù）據進行統計分析（xī），根據上述公式計算效價(y)為934.2μ/mg，同時統計分析得（dé）自由（yóu）度f=(k-1)(n-1)=27，其合（hé）並樣本標準（zhǔn）差（chà）即標準（zhǔn）不確定度為:
    

　　相對標準不確定度為:
　　u(x₁)_rel=u(x₁)/y=0.159/934.24=1.70×10^-4

　　(2)抑菌（jun1）圈測量儀的不確定度（dù）分量u(x₂)
    

　　抑菌圈測量儀的最大允許誤差為±0.02mm，則區間半寬（kuān）度aP=0.02mm，測量值落在該區間的概率（lǜ）分布為均勻分布，包含因子，其標準不確定（dìng）度為:
　　移菌圈測量儀的標準圈直（zhí）徑為19mm，其相對標準不確定度（dù）為:
    

　　(3)配製溶液的不確定度分量（liàng）u(x₃)
　　①標準品溶液的不確定度（dù）u_s(x₃)
　　a.定容（róng）體積V的標準不確定度u_v，A級100.00mL單標線容量瓶的容量誤差（chà）允許±0.1mL，按三（sān）角分布考慮（lǜ），取，則標準不確定（dìng）度，相對標準不確定度為0.04/100=0.0004。

　　用A類方（fāng）法評定，即通過對容量瓶的重複實驗可以估算（suàn）定容變動產生的不確定度。液（yè）體（tǐ）的體積與其比重的乘（chéng）積等於其（qí）重量，同一液體的比重為常數，因此可以對典型的100mL容量瓶定容10次，並稱量求取其標準偏差來評（píng）價其容量配置的重（chóng）複性。采（cǎi）用貝塞爾方法計算標準偏差，標準不確定度等於1倍標（biāo）準偏差，用A級100.00mL容（róng）量瓶（píng）配（pèi）製溶（róng）液，稀釋至刻度線的度數，重複性引起的不確定（dìng）度為0.04mL。配置溶液時，水溫接近20℃，因而溫度的影響可忽略不計，則定容體積V的標（biāo）準不確定度為:，相對標準不確定度為（wéi）:u_v1rel=0.06/100.00=0.0006。
　　同樣地，50.00mL容量瓶的標準不確定度與相對標準不確定度分別為:u_v2=0.05mL與u_v2rel=0.0005。
　　使用100.00mL容量瓶1次與50.00mL容量瓶3次，因此定容體積的合（hé）成標（biāo）準不確定度為:
    

　　b.移（yí）取溶液的（de）不確定度分（fèn）量（liàng）u_νyrel
　　考慮到（dào）移取溶液體（tǐ）積（jī）量，認為移取溶液的不確定度來自於移液管刻度的不確定度，根據規定，5mL移液管的最大允許誤差為（wéi）±0.015mL，按三角（jiǎo）分布考慮，取，則（zé）。

　　用A類方法評定，重複性引起的不確定度為（wéi）0.008mL。配置溶液時，水溫接近（jìn）20℃，因（yīn）而溫度的影響（xiǎng）可忽略不（bú）計，使用移（yí）液管2次，則移取溶液的標準不確定度為:，相對標準不確定度為:。
    c.標準品純度引（yǐn）起的不確定度u_mc
    阿奇黴素標準品含量的標（biāo）準不確定度為1%，取，則
    d.標準（zhǔn）品質量的標準不確定度u_m
    天平使用說明書給出的（de）天平的分辨力（lì）為0.01mg，包含因子，則天平的不（bú）確定度
    天平使用說明書給出的天平的重複性誤差為0.02mg，認為服從矩形分布，包含因子，則（zé）稱量重複性（xìng）不確定度
    標（biāo）準品質量的相對標準不確定度
    合成標（biāo）準（zhǔn）品溶液的不確定（dìng）度u_s(x₃)
    

    ②供試品溶液的不確定度u_T(x₃)
    同樣計算:
    a.定容體積V的標準不確定度u_vrel
    

    b.移取溶液的不確（què）定度分量（liàng）u_νyrel
    

    c.供試品質量的標準不確定度（dù）u_m
    供試品質量的相對（duì）標（biāo）準不確定度u_mrel
    

    合（hé）成供試品溶液的不確定度u_T(x₃)
    

    因而配製溶液的不確定度（dù）
    

　　3.總合成（chéng）標準不確定度u(y)
　　合成標準不確定度由抑菌圈直徑（jìng）值觀測列的不（bú）確定（dìng）度即A類不確定度（dù）u(x₁)與B類不確定度即移菌（jun1）圈測量儀的標準不確定度u(x₂)、配置溶液的不確定度u(x₃)組成，它們是各自獨立的分量，因而可按方（fāng）和根方式進行合成標準不確定度的計算:    

　　4.擴展不確定度
　　實驗結果一（yī）般（bān）用擴展不確（què）定度表（biǎo）示。u(y)/y=0.0030，y=934.24μ/mg，u(y)=0.0030×934.24μ/mg=2.80μ/mg。取包含因子k=2(置信概率（lǜ）約為95%)，則（zé）擴展（zhǎn）不確定度為U=2u(y)=2×2.80μ/mg=5.6μ/mg。阿奇黴素效價測定的結果可表示為:(934.2±5.6)μ/mg(k=2)。    

　　三（sān）、總結（jié）

　　不同參數對效價測定不確定度的貢（gòng）獻不同，標準品質量與供試品質量（liàng）對（duì）不確定度的貢獻最大；其次為移液管體積不確定度與（yǔ）容量瓶體積不確定度；標準品純度的不確定度、抑菌圈直（zhí）徑值的不確定度及（jí）抑菌圈測量儀不確定（dìng）度實際上對總（zǒng）不確定度沒有影響。

　　根據效價測定的特點，其操作方法可分為供（gòng）試品和標準品的稱量、供試品和標準品溶液（yè）的製備、雙碟的製備與培養、抑菌圈直徑值的測量（liàng）與效價（jià）計算等步驟，因此，在計算時（shí），應先分別計算各過程的不確定度，再計算合成相對不確定度，這樣方便理解和計算。
　　作者單位【河南省藥品檢驗所】