山東出入境檢驗檢疫局　高宏偉  劉心同  陳世山  丁（dīng）士兵  昃向君　中國計量（liàng）科學研（yán）究院  施昌（chāng）彥

　　一、目標

　　按ISO21570(Foodstuffs-Detection of genetically modified organisms and derived products-Quantitative nucleic acid based methods)測定（dìng）大（dà）豆樣品中轉（zhuǎn）基因（yīn）大豆含量定量檢測的不確定度。
　　本課（kè）題是對動植物（wù）檢驗檢疫領（lǐng）域（yù）定量檢測項目進行不確定（dìng）度評定的（de）嚐試。    

　　二、測量程（chéng）序

　　1.DNA提取
　　大豆DNA的提取（qǔ），按照國際標準（zhǔn）草稿（gǎo）ISO/DIS 21571(Foodstuffs - Methods of analysis for the detection of genetically modified organisms and derived products -Nucleic acid extraction)進行。

　　2.定量（liàng）檢測
　　(1)陽性參照（zhào）標準品的設立(可任（rèn）選（xuǎn）其一)。
　　(2)將轉基因大豆標準物質(%)的DNA，調整至相同濃度(ng/μL)，作為定量反應的模板。
　　(3)對（duì）含有待檢外源基因和內源基因（yīn）的陽性質粒DNA，將其（qí）濃度調整（zhěng）為（wéi）相同體積含有不同DNA拷貝數(如:0、10、100、1000、10000拷貝/5μL或0.01、0.1、1、10、100pg/μL的DNA)，作為定量反應的模板。
　　(4)實時（shí）熒光PCR反應體係。
　　實時熒光PCR反應體係見表1，引物序列按ISO21570的規定。
    

　　(5)實時熒光PCR反應參數。
　　實時熒光PCR的（de）反（fǎn）應參數為:50℃/2min；預變性95℃/3min；95℃/15s，60℃/1min，40個循環。

　　(6)上機運行。
　　按預先設定的樣品擺放順序（xù），依次擺放PCR反應管（guǎn），在樣（yàng）品名輸入處編輯實時熒光（guāng）PCR反應參數並開始運行儀器。運行結束後分析並保存數據。

　　(7)基線的設置和（hé）數據記錄。
　　反應結束並分析結果後，應設（shè）置無（wú）效基線範圍。無論采用哪（nǎ）條熒光（guāng）通道(FAM或TET)，基線（xiàn）範圍選擇在3～15個循環，閾值設置原則上以基線（xiàn）剛（gāng）好（hǎo）超過正（zhèng）常陰性對照擴增曲線的最高點，且以Ct值等於40為準。

　　(8)使用（yòng）質粒作為定量（liàng）檢測參照物的（de）結果計算。
　　①繪製（zhì）標（biāo）準曲線和推導回歸方程
　　根據（jù）標準（zhǔn）物質中含有的作物內源基因和（hé）外源（yuán）基因的量，以（yǐ）及所得Ct值之間（jiān）的對（duì）應關（guān）係，分別以Ct值為縱坐標，以內源基因或外源基因量的對數為橫坐標，擬合標準曲線並可分別得到（dào）內（nèi）源基因或外源基因的線性回歸方程。
    
　　式中:A——樣品（pǐn）中內源基因或外源基因的量（liàng）；Ct——樣品的Ct值；k——標準曲線在y軸的截距；m——標準曲線的斜率。
　　②待測樣品中轉基因成分含量的計算
　　將所測得的（de）待測樣品外源基因或內源基因的Ct值代入各自的回歸方程，計算出樣品中內源基因或外源基因的拷貝數。根據公式(1)計算樣品中轉基因成分的百分含量。
    
    式中（zhōng）:C——樣品中（zhōng）轉基因成分（fèn）的百分含量，%；A_外——樣品中外源基因的量；A_內——樣品中內源基（jī）因量。    

　　三、檢測結果(如圖1所示)

    圖1  檢測結果

　　對1個含轉基因大豆的大豆樣品做7次平行測定，結果見表2。
    

　　四、數學模型

　　
　　式中（zhōng）:C——樣品中（zhōng）轉基因成分（fèn）的百分含量，%；Ct——樣品中外源基因或內源（yuán）基因的Ct值；k——標準品中外源基因或內源基因的標（biāo）準曲線在y軸上（shàng）的截距；m——標準品中外源基因或內源基（jī）因的標準曲線的（de）斜率。    

　　五、不確（què）定度來源(如圖2所（suǒ）示)    

    圖2  樣品測量不（bú）確定度來源因果圖

　　六、標準不確定度評定

　　1.A類標準不確定度評定
　　A類不確定度（dù）由各類隨機效（xiào）應引起，計算如下（xià）:
　　
    

　　2.B類標準不確定度評定
　　(1)標準曲線讀數Ct值的標準不確定度
　　標準係列樣品的測量值和計算數據如表3和表4所示，用最小二乘法計（jì）算曲線方程（chéng）。
    

    在樣品實際檢測中，標準曲線隻做1個重複，在（zài）測量點（diǎn）A_外=0.031和A_內=0.845處，Ct_{外（wài）}=30.340和（hé）Ct_內=25.040(平均值)，由標準（zhǔn）曲（qǔ）線引（yǐn）入的標（biāo）準不確定度分量計算如（rú）下（xià）:
    在試樣的測量次數p=1時，最小二乘法引入（rù）的不確定度分量為:
    
    式中:s(1gA)——由標準溶液Ct值殘差計算的標準差（chà）；n——標準溶液的測定次數；lgA₀——實測點濃度的對數。
    
    故其相對標準不確（què）定度為:
    
    內源基因標準曲線的不（bú）確定度u(Ct內)分量（liàng）為:
    
    故其相（xiàng）對標準不確定度為:
    
    標準曲線的不確（què）定度是用統（tǒng）計原理（lǐ）計算得到的，其自由（yóu）度為n-2。所以:
    

　　(2)移液槍的標準不確定度
    移液槍造成的不確定度呈均勻分布。
    移液槍（qiāng）在其測量範圍（wéi）(10～100)μL(V₀)內的最大允差為±0.1μL，由此帶來的標準不確定度(μL)。使用的加樣體積為12.5μL，故其相對標準不確定度為u_rel1=0.0577/12.5=0.0046。
    移液槍在其測量範圍(0.5～10)μL(V₁)內的（de）最大允差為（wéi）±0.02μL，由此帶來的標準不確定度u₂=0.02/=0.0115(μL)。使用的（de）加樣體積分別為2μL、2μL、8.2μL，故其（qí）相對標（biāo）準不確定度分別為u_rel2=0.0115/2=0.0057、u_rel3=0.0115/2=0.0057、u_rel4=0.0115/8.2=0.0014。
    移（yí）液槍（qiāng）在其測（cè）量範圍(0.1～2.5)μL(V₁)內的最大允差為（wéi）±0.002μL，由此（cǐ）帶來的標準不確（què）定度u₃=0.002/=0.0011(μL)。使用的加樣體積為0.3μL，故其相對標準不確定度（dù）為u_rel5=0.0011/0.3=0.0036。
    考慮到各範圍測量的獨立性，移液槍允差帶來的合成相對（duì）不確定度為:
    
    標準不確定（dìng）度以最大偏差估計，其自由度可取為無窮大，即ν₃=ν₄=ν₅=∞。

　　(3)B類標準不確定度的合成
    B類不確定度各分（fèn）量u_rel外，u_rel內，u_rel槍相互獨（dú）立（lì），所（suǒ）以其靈敏（mǐn）係數均為1，u_rel外，u_rel內，u_rel槍合成為B類合成標準不確定度u_ref:
    

　　3.合成標準不確定度評定
　　考慮到A類（lèi）標（biāo）準不確定度和B類標準不確定度相互獨立，則
    
    

　　七（qī）、擴展不確定度評定和報告

　　U=k×u_c，包含因子k為置信水準p=95%、自由度（dù）ν=6的t分布臨界值，按非整ν內插計（jì）k=2.45，故U=2.45×0.5201%=1.3%。
　　測量結果C%=3.73%±1.3%，其中（zhōng）1.27%是擴展不確定度U，它取決於合成標準不確定（dìng）度u_c=0.5201%和包含因子k=2.45，k的值基（jī）於置信水準p=95%、自由度ν=6的t分布。

　　致謝:本文得到了國家質量監督（dū）檢驗檢疫總局課題《食品安全（quán）實驗室質量管理、技術運作（zuò）和評審認可體係的研究》(2003IK037)的資助（zhù）。